فیلتراسیون جریان مماسی TFF همراه با اولتراسانتریفیوژ برای آماده سازی کارآمد وزیکول های خارج سلولی کوچک

وزیکول‌های خارج سلولی کوچک (sEVs) وزیکول‌هایی در مقیاس نانو هستند که توسط سلول‌هایی ترشح می‌شوند که حاوی اسیدهای نوکلئیک، پروتئین‌ها، مولکول‌های کوچک و سایر اجزا هستند و نقش مهمی در ارتباطات بین سلولی دارند. وزیکول‌های خارج سلولی کوچک از نوع اگزوزومی شباهت‌های زیادی با سلول‌های والد خود دارند. در مقایسه با نانوذرات مصنوعی، میزان پاکسازی ایمنی پایین‌تر و سمیت سلولی کمتری از خود نشان می‌دهند که آنها را به عنوان نامزدهای جدید تبدیل می‌کند.وسایل نقلیه تحویل دارو در داخل بدن. تقریباً همه انواع سلول ها می توانند این وزیکول ها را ترشح کنند و تحقیقات در مورد کاربرد آنها به عنوان حامل دارو به تدریج از آزمایشگاه به سمت کاربردهای بالینی حرکت می کند. با این حال،تولید-در مقیاس بزرگ همچنان یک گلوگاه بزرگ است.

 

روش های فعلی برای جداسازی وزیکول خارج سلولی

روش های فعلی جداسازی وزیکول خارج سلولی عبارتند ازاولتراسانتریفیوژ، سانتریفیوژ با گرادیان چگالی، اندازه-کروماتوگرافی حذفی (SEC) و رسوب پلی اتیلن گلیکول (PEG).

بارش PEG عملکرد بالا و عملیات ساده را ارائه می دهد، اما با آلودگی قابل توجهی توسط پروتئین های ناخواسته همراه است. سانتریفیوژ گرادیان چگالی و کروماتوگرافی حذف اندازه-می‌تواند محصولاتی با خلوص{{2}بالا ارائه کند، اما کارایی آنها نسبتاً پایین است و فرآیندها زمان‌بر هستند. اولتراسانتریفیوژ به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرد، اما حجم پردازش آن به دلیل ظرفیت سانتریفیوژ محدود شده است و افزایش آن را دشوار می کند.

 

استفاده از فیلتراسیون جریان مماسی برای جداسازی sEV

فیلتراسیون جریان مماسی (TFF) قبلاً برای جداسازی نانوذراتی مانند لیپوزوم ها و ناقل های لنتی ویروسی اعمال شده است. در TFF، خوراک به صورت مماس در سراسر سطح غشاء جریان می یابد، که به کاهش رسوب غشاء کمک می کند و فرآیند را آسان تر می کند.

از آنجایی که وزیکول های خارج سلولی کوچک به طور کلی از30-200 نانومتردر قطر، aکاست غشایی 0.45 میکرومتررا می توان در سیستم TFF برای حذف پروتئین ها و وزیکول های بزرگتر انتخاب کرد، در حالی که الفکاست غشایی 300 کیلو دالتونمی توان برای حذف پروتئین های کوچک مولکولی-و تغلیظ وزیکول های خارج سلولی کوچک موجود در محیط کشت استفاده کرد.

 

خصوصیات مواد اولیه پس از جداسازی TFF

تجزیه و تحلیل ردیابی نانوذرات (NTA) نشان داد که قطر ذرات عمدتاً در محدوده توزیع شده است.0-250 نانومتر.

 

 

با این حال، میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) مقدار زیادی پروتئین آلوده کننده را نشان داد، در حالی که هیچ وزیکول خارج سلولی مشاهده نشد. این نتایج نشان داد که برای خالص‌سازی بیشتر وزیکول‌های خارج سلولی، یک مرحله تصفیه پایین‌دست اضافی مورد نیاز است.

 

مشخصات کنسانتره TFF پس از اولترافیلتراسیون 100 کیلو دالتون

کنسانتره TFF بیشتر با استفاده از یک پردازش شدلوله اولترافیلتراسیون 100 کیلو دالتون.

NTA نشان داد که قطر ذرات در کنسانتره های به دست آمده پس از یک و دو دور اولترافیلتراسیون عمدتاً در محدوده0-250 نانومتر. با این حال، انجام اولترافیلتراسیون دو بار منجر به کاهش قابل توجهی در تعداد ذرات به‌دست‌آمده شد.

تجزیه و تحلیل TEM نشان داد که هیچ ساختاری شبیه به وزیکول-در کنسانتره اولترافیلتراسیون یک بار یا دو بار مشاهده نشد، در حالی که مقدار قابل توجهی از پروتئین آلوده باقی مانده بود.

بنابراین،اولترافیلتراسیون 100 کیلو دالتون نمی تواند به طور موثر برای خالص سازی محیط کشت پس از غلظت TFF استفاده شود..

 

 

خصوصیات کنسانتره TFF خالص شده توسط اولتراسانتریفیوژ

NTA نشان داد که قطر ذرات محصولات خالص شده عمدتاً در محدوده توزیع شده است0-250 نانومتر.

نکته مهم این است که TEM به وضوح ساختارهایی شبیه وزیکول- را در میدان های دید مختلف نشان داد. این نتایج نشان داد که پس از تغلیظ محیط کشت با استفاده از TFF،متعاقباً می توان از اولتراسانتریفیوژ برای جداسازی و خالص سازی بیشتر وزیکول های خارج سلولی استفاده کرد..

 

 

خصوصیات sEV های جدا شده از محیط شرایط سلول های بنیادی مزانشیمی با استفاده از TFF همراه با اولتراسانتریفیوژ

NTA نشان داد که قطر ذرات محصولات خالص شده عمدتاً در محدوده توزیع شده است0-250 نانومتر.

ساختارهای{0}مانند وزیکول توسط TEM مشاهده شد. تجزیه و تحلیل وسترن بلات بیان مثبت پروتئین های مرتبط با وزیکول خارج سلولی را نشان دادCD9، CD63 و ALIXدر وزیکول های خارج سلولی خالص شده

این نتایج تایید کرد که وزیکول های خارج سلولی کوچک خالص حاوی اگزوزوم هستند، که نشان می دهد این روش می تواند برایجداسازی و استخراج اگزوزوم.

 

 

نتیجه‌گیری: TFF همراه با اولتراسانتریفیوژ برای آماده‌سازی sEV با کیفیت بالا-

مطالعه نشان داد کهغلظت TFF به تنهاییمنجر به محصولی شد که حاوی مقدار قابل توجهی از پروتئین های آلوده کننده بود و بنابراین برای به دست آوردن وزیکول های خارج سلولی واجد شرایط کافی نبود.

به همین ترتیب، با استفاده از aلوله اولترافیلتراسیون 100 کیلو دالتون برای تصفیه ثانویهبه طور موثر ساختار وزیکول دست نخورده را ایجاد نکرد.

با ترکیب غلظت TFF با تصفیه اولتراسانتریفیوژ بعدی، می توان مزایای هر دو روش را برای به دست آوردن یکپارچه کرد.محصولات وزیکول خارج سلولی کوچک-با کیفیت بالا.

در مقایسه با اولتراسانتریفیوژ معمولی به تنهایی، فرآیند ترکیبی می تواند به طور موثری انجام شودکاهش زمان کلی پردازش و بهبود کارایی جداسازی.

در این گردش کار،TFF غنی سازی سریع نمونه های حجم-بزرگ را امکان پذیر می کند، پرداختن به محدودیت اولتراسانتریفیوژ معمولی در پردازش حجم نمونه بزرگ. سپس اولتراسانتریفیوژ، تصفیه عمیق را برای حذف ناخالصی‌های پروتئینی متمرکز انجام می‌دهد و در عین حال به حفظ خلوص و یکپارچگی وزیکول‌ها کمک می‌کند.

علاوه بر این، این فرآیند نیازی به اضافه کردن نداردمعرفهای رسوب شیمیایی اگزوژن، به حفظ فعالیت بیولوژیکی وزیکول ها تا حد ممکن کمک می کند.

از منظر ترجمه صنعتی، این فرآیند قابل توجه استپتانسیل- را افزایش دهیدو ممکن است به رفع چالش‌های مرتبط با-تولید وزیکول‌های خارج سلولی در مقیاس بزرگ کمک کندتحویل دارو، پزشکی احیا کننده و توسعه محصول مرتبط. همچنین مبنای آزمایشی محکمی برای بهینه سازی فرآیند بعدی و تولید آزمایشی-در مقیاس فراهم می کند.

 

مرجع

وانگ لینگ، لی منگشی، زو شا، و همکاران.ایجاد روشی برای جداسازی وزیکول های خارج سلولی کوچک با فیلتراسیون جریان مماسی همراه با اولتراسانتریفیوژ. مجله بیولوژیکی چینی، 2022، 35 (9): 1096-1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.