مطالعه بهینه سازی فرآیند تصفیه پایین دستی آبگوشت برداشت جنین مرغ برای ویروس آنفلوانزا نوع IV (قسمت 2)

اثرات فرآیندهای مختلف غلظت اولترافیلتراسیون بر کیفیت مایع شفاف شده از ویروس آنفلوانزای نوع IV

کنسانتره ویروس آنفولانزا دارای حجم زیاد، محتوای هماگلوتینین کم و سطوح بالایی از ناخالصی ها و پروتئین ها است که نیاز به غلظت اولترافیلتراسیون قبل از پردازش بعدی دارد. اولترافیلتراسیون یک روش ارجح برای غلظت تولید در مقیاس خفیف-می باشد. مطالعات نشان داده اند که یک سیستم فیبر توخالی 750 کیلو دالتون می تواند محتوای اووالبومین کنسانتره را به میزان قابل توجهی کاهش دهد، در حالی که مطالعه دیگری نشان می دهد که یک سیستم کپسوله سازی غشایی 1000 کیلو دالتون می تواند ناخالصی ها و پروتئین های کنسانتره آنفلوانزای پرندگان را به میزان قابل توجهی کاهش دهد. پس از بررسی ادبیات گسترده و مقایسه دو دستگاه غلظت اولترافیلتراسیون رایج، سیستم فیبر توخالی 750 کیلو دالتون و سیستم کپسوله سازی غشایی 1000 کیلو دالتون، با همه شرایط یکسان به جز سیستم عامل، فرآیند غلظت اولترافیلتراسیون بهینه بر اساس نتایج آزمایش تعیین شد.

نتایج آزمون در شکل 4-9 نشان داده شده است. UA1-1 نشان دهنده میانگین سه دسته کنسانتره اولترافیلتراسیون فیلتر شده با استفاده از یک سیستم فیبر توخالی 750kd، UA1-2 نشان دهنده میانگین سه دسته از کنسانتره اولترافیلتراسیون فیلتر شده با استفاده از یک سیستم غشایی 1000kd و غیره است.

شکل 4. نتایج تشخیص کنسانتره ویروس آنفلوانزا - محتوای پروتئین کل

شکل 5. نتایج تشخیص کنسانتره ویروس آنفلوانزا - محتوای اووالبومین

شکل 6. نتایج تشخیص کنسانتره ویروس آنفلوانزا - میزان حذف کل پروتئین

شکل 7. نتایج تشخیص کنسانتره ویروس آنفلوانزا - تیتر هماگلوتیناسیون

شکل 8. نتایج تشخیص کنسانتره ویروس آنفلوانزا - بازده تیتر غلظت

شکل 9. نتایج تشخیص کنسانتره ویروس آنفلوانزا - محتوای هماگلوتینین

 

نتایج نشان داد که سطح اندوتوکسین باکتریایی در تمام گروه‌های کنسانتره ویروس آنفولانزا زیر 60 EU/mL بود. هیچ تفاوت آماری معنی داری در محتوای اووالبومین، تیتر هماگلوتیناسیون، محتوای هماگلوتینین و بازده تیتر غلظت وجود نداشت که ممکن است به ساختار ویروس آنفولانزا مربوط باشد. با این حال، تیمار با سیستم غشایی 1000 کیلو دالتون کاهش در محتوای پروتئین کل سویه‌های آنفولانزا V و BY و همچنین کاهش سرعت حذف کل پروتئین سویه‌های H3N2 و BY آنفولانزا را نشان داد. علاوه بر این، سیستم غشایی 1000 کیلو دالتون زمان کمتری برای متمرکز کردن همان حجم محلول شفاف شده صرف کرد که نشان دهنده مزیتی از نظر هزینه زمانی است. بنابراین، سیستم غشایی 1000 کیلو دالتون برای غلظت اولترافیلتراسیون کنسانتره ویروس آنفولانزا سویه‌های آنفلوانزا V انتخاب شد.

 

تأثیر نسبت های مختلف غلظت بر کیفیت محلول شفاف شده ویروس آنفلوانزا نوع IV

فاکتور تغلیظ یک مرحله حیاتی در تصفیه است که ارتباط نزدیکی با بازده پروتئین هدف، زمان غلظت و ایمنی سیستم غلظت دارد. یک سیستم کپسولاسیون غشایی 1000 کیلو دالتون برای مطالعات غلظت اولترافیلتراسیون انتخاب شد . 60 لیتر مایع آلانتوئیک از هر یک از چهار نوع ویروس آنفولانزا (UA1، UA3، UB1، و UB2) جمع آوری شد و تحت سانتریفیوژ جریان مداوم و شفاف سازی چند مرحله ای از هر محلول 54 قرار گرفت. هر محلول شفاف شده به 9 گروه 6 لیتری تقسیم شد و فاکتورهای غلظت 30، 40 و 50 مورد بررسی قرار گرفت و هر عامل سه بار تکرار شد تا تکرارپذیری و پایداری تأیید شود. حجم نهایی مربوطه به ترتیب 0.2 L، 0.15 L و 0.12 L بود.

نمونه‌ها برای آزمایش محتوای پروتئین کل، سرعت حذف پروتئین کل، تیتر هماگلوتیناسیون، بازده تیتر غلظت و محتوای هماگلوتینین گرفته شد. نتایج آزمون در شکل 10-14 . نشان داده شده است.

 

شکل 1.0 نتایج غلظت محلول مشخص شده ویروس آنفلوانزا سروتیپ 4 در نسبت غلظت های مختلف - محتوای پروتئین کل

شکل 1.1 نتایج غلظت محلول شفاف شده ویروس آنفلوانزا نوع IV پس از نسبت غلظت های مختلف - سرعت حذف کل پروتئین

شکل 12. نتایج تشخیص ویروس آنفولانزا سروتیپ IV مایع شفاف شده پس از غلظت در نسبت غلظت های مختلف - تیتر هماگلوتیناسیون

شکل 1.3 نتایج غلظت محلول شفاف شده ویروس آنفلوانزا از انواع مختلف پس از نسبت غلظت های مختلف - تیتر غلظت و بازده

شکل 14. نتایج تشخیص محتوای هماگلوتینین در محلول شفاف شده ویروس آنفلوانزا نوع IV پس از غلظت در نسبت های مختلف غلظت.

 

نتایج نشان داد که برای نسبت‌های غلظتی مختلف، نسبت‌های غلظت پایین‌تر نشان‌دهنده محتوای پروتئین کل کمتر و میزان حذف پروتئین کل، و همچنین تیتر هماگلوتیناسیون کمتر، بازده تیتر غلظت و محتوای هماگلوتینین است. نسبت غلظت بالاتر می‌تواند از این مسائل جلوگیری کند، اما تقاضاهای بالاتری را برای سیستم ایجاد می‌کند، فشار عملیاتی سیستم را افزایش می‌دهد و احتمالاً تلفات را افزایش می‌دهد. علاوه بر این، افزایش فشار منجر به طولانی‌تر شدن زمان تولید و در نتیجه افزایش هزینه‌های زمانی می‌شود. با در نظر گرفتن همه عوامل، نسبت غلظت 30-40 برابر بهینه بود.

 

تأثیر فرآیندهای مختلف تصفیه بر کیفیت ویروس آنفلوانزای غلیظ نوع IV

نتایج نشان داد که خالص سازی Capto Core 700 نرخ حذف پروتئین کل و اووالبومین و محتوای پروتئین کل و اووالبومین کمتر، اما میزان و بازده هماگلوتینین کمتری را به همراه داشت. از سوی دیگر، سانتریفیوژ گرادیان چگالی ساکارز، محتوای هماگلوتینین و بازده بالاتری را به دست آورد. علاوه بر این، بازده هماگلوتینین Capto Core 700 به طور مداوم بالای 50٪ بود، کمی کمتر از سانتریفیوژ گرادیان چگالی ساکارز. با این حال، با توجه به اینکه سانتریفیوژ با گرادیان چگالی ساکارز پس از خالص‌سازی نیاز به ساکارز زدایی دارد، زمان‌برتر است و منجر به تلفات بیشتر می‌شود، Capto Core 700 روش ترجیحی است. روش تصفیه Core 700 به عنوان یک روش تصفیه برای ویروس آنفلوانزای غلیظ نوع IV برتر است.

منابع: هوانگ، ژنتیان. بهینه سازی فرآیند تولید پایین دستی برای واکسن اسپلیت ویروس آنفلوانزای چهار ظرفیتی [D]. دانشگاه کشاورزی Shenyang، 2024. DOI:10.27327/d.cnki.gshnu.2024.001595.